uudised

Viimase kümnendi jooksul on geenijärjestuse tehnoloogiat laialdaselt kasutatud vähiuuringutes ja kliinilises praktikas, olles saanud oluliseks vahendiks vähi molekulaarsete omaduste paljastamisel. Molekulaardiagnostika ja sihipärase ravi edusammud on edendanud kasvaja täppisravi kontseptsioonide arengut ning toonud kaasa suuri muutusi kogu kasvajate diagnoosimise ja ravi valdkonnas. Geneetilisi teste saab kasutada vähiriski hoiatamiseks, raviotsuste suunamiseks ja prognoosi hindamiseks ning need on olulised vahendid patsientide kliiniliste tulemuste parandamiseks. Siin võtame kokku hiljutised artiklid, mis on avaldatud CA Cancer J Clini, JCO, Ann Oncoli ja teistes ajakirjades, et anda ülevaade geneetilise testimise rakendamisest vähi diagnoosimisel ja ravis.

Somaatilised mutatsioonid ja iduliini mutatsioonid. Üldiselt on vähk põhjustatud DNA mutatsioonidest, mis võivad pärida vanematelt (iduliini mutatsioonid) või omandada vanusega (somaatilised mutatsioonid). Suguliini mutatsioonid esinevad sünnist saati ja mutator kannab tavaliselt mutatsiooni iga keharaku DNA-s ning seda saab edasi anda järglastele. Somaatilised mutatsioonid omandavad indiviidid mitte-gameetilistes rakkudes ja neid tavaliselt järglastele ei edastata. Nii iduliini kui ka somaatilised mutatsioonid võivad hävitada rakkude normaalse funktsionaalse aktiivsuse ja viia rakkude pahaloomulise muundumiseni. Somaatilised mutatsioonid on pahaloomulisuse peamine edasiviija ja onkoloogias kõige ennustavam biomarker; aga umbes 10–20 protsenti kasvajaga patsientidest kannavad iduliini mutatsioone, mis suurendavad oluliselt nende vähiriski, ja mõned neist mutatsioonidest on ka terapeutilised.
Juhtmutatsioon ja reisimutatsioon. Kõik DNA variandid ei mõjuta rakkude funktsiooni; keskmiselt kulub normaalse rakkude degeneratsiooni käivitamiseks viis kuni kümme genoomset sündmust, mida nimetatakse "juhtmutatsioonideks". Juhtmutatsioonid esinevad sageli geenides, mis on tihedalt seotud rakkude elutegevusega, näiteks geenides, mis osalevad rakkude kasvu reguleerimises, DNA parandamises, rakutsükli kontrollis ja muudes eluprotsessides, ning neil on potentsiaali olla terapeutilisteks sihtmärkideks. Mutatsioonide koguarv igas vähivormis on aga üsna suur, ulatudes mõnest tuhandest mõnes rinnavähis kuni enam kui 100 000-ni mõnes väga varieeruvas kolorektaalses ja endomeetriumi vähis. Enamikul mutatsioonidel puudub või on piiratud bioloogiline tähtsus, isegi kui mutatsioon esineb kodeerivas piirkonnas, nimetatakse selliseid ebaolulisi mutatsioonisündmusi "reisijamutatsioonideks". Kui teatud tüüpi kasvaja geenivariant ennustab selle ravivastust või -resistentsust, peetakse varianti kliiniliselt opereeritavaks.
Onkogeenid ja kasvaja supressorgeenid. Vähis sageli muteeruvad geenid võib laias laastus jagada kahte kategooriasse: onkogeenid ja kasvaja supressorgeenid. Normaalsetes rakkudes mängib onkogeenide poolt kodeeritud valk peamiselt rakkude proliferatsiooni soodustamise ja rakkude apoptoosi pärssimise rolli, samas kui onkosupressorgeenide poolt kodeeritud valk vastutab peamiselt rakkude jagunemise negatiivse reguleerimise eest, et säilitada normaalne rakkude funktsioon. Pahaloomulise transformatsiooni protsessis viib genoomne mutatsioon onkogeeni aktiivsuse suurenemiseni ja onkosupressorgeeni aktiivsuse vähenemiseni või kadumiseni.
Väike variatsioon ja struktuuriline variatsioon. Need on genoomis esinevad kaks peamist mutatsioonitüüpi. Väikesed variandid muudavad DNA-d, muutes, kustutades või lisades väikest arvu aluseid, sealhulgas aluse sisestamine, deletsioon, lugemisraami nihutamine, startkoodoni kadu, stoppkoodoni kadu mutatsioonid jne. Struktuurne variatsioon on suur genoomi ümberkorraldus, mis hõlmab geenisegmente, mille suurus ulatub mõnest tuhandest alusest kuni suurema osa kromosoomini, sealhulgas geenikoopiate arvu muutused, kromosoomi deletsioon, dubleerimine, inversioon või translokatsioon. Need mutatsioonid võivad põhjustada valgu funktsiooni vähenemist või suurenemist. Lisaks muutustele üksikute geenide tasandil on genoomsed signatuurid osa ka kliinilistest sekveneerimisaruannetest. Genoomseid signatuure võib vaadelda kui väikeste ja/või struktuuriliste variatsioonide keerulisi mustreid, sealhulgas kasvaja mutatsioonikoormus (TMB), mikrosatelliidi ebastabiilsus (MSI) ja homoloogsed rekombinatsioonidefektid.

Klonaalsed mutatsioonid ja subklonaalsed mutatsioonid. Klonaalsed mutatsioonid esinevad kõigis kasvajarakkudes, esinevad diagnoosimise ajal ja jäävad püsima ka pärast ravi edenemist. Seetõttu on klonaalsetel mutatsioonidel potentsiaali kasutada kasvaja terapeutiliste sihtmärkidena. Subklonaalsed mutatsioonid esinevad ainult osades vähirakkudes ja neid võidakse diagnoosimise alguses tuvastada, kuid need kaovad järgneva kordumise korral või ilmuvad alles pärast ravi. Vähi heterogeensus viitab mitme subklonaalse mutatsiooni esinemisele ühes vähivormis. Märkimisväärne on see, et valdav enamus kliiniliselt olulistest juhtmutatsioonidest kõigis levinud vähiliikides on klonaalsed mutatsioonid ja püsivad kogu vähi progresseerumise ajal stabiilsena. Resistentsust, mida sageli vahendavad subkloonid, ei pruugita diagnoosimise ajal tuvastada, kuid see ilmneb siis, kui see pärast ravi retsidiveerub.

Traditsioonilist FISH-meetodit ehk raku karüotüüpi kasutatakse muutuste tuvastamiseks kromosoomitasandil. FISH-meetodit saab kasutada geenide fusioonide, deletsioonide ja amplifikatsioonide tuvastamiseks ning seda peetakse selliste variantide tuvastamise „kuldstandardiks“, millel on suur täpsus ja tundlikkus, kuid piiratud läbilaskevõime. Mõnede hematoloogiliste pahaloomuliste kasvajate, eriti ägeda leukeemia korral kasutatakse karüotüüpimist endiselt diagnoosi ja prognoosi suunamiseks, kuid seda tehnikat asendavad järk-järgult sihipärased molekulaarsed testid, nagu FISH, WGS ja NGS.
Muutusi üksikutes geenides saab tuvastada PCR-meetodil, nii reaalaja PCR-meetodil kui ka digitaalse tilk-PCR-meetodil. Need tehnikad on kõrge tundlikkusega, sobivad eriti hästi väikeste jääkkahjustuste tuvastamiseks ja jälgimiseks ning võimaldavad tulemusi saada suhteliselt lühikese aja jooksul, puuduseks on piiratud avastamisulatus (tavaliselt tuvastatakse mutatsioone ainult ühes või mõnes geenis) ja mitmete testide tegemise võimalus on piiratud.
Immunohistokeemia (IHC) on valgupõhine jälgimisvahend, mida tavaliselt kasutatakse selliste biomarkerite nagu ERBB2 (HER2) ja östrogeeniretseptorite ekspressiooni tuvastamiseks. IHC-d saab kasutada ka spetsiifiliste muteerunud valkude (näiteks BRAF V600E) ja spetsiifiliste geenifusioonide (näiteks ALK fusioonide) tuvastamiseks. IHC eeliseks on see, et seda saab hõlpsasti integreerida rutiinsesse koeanalüüsi protsessi, seega saab seda kombineerida teiste testidega. Lisaks saab IHC anda teavet subtsellulaarse valgu lokaliseerimise kohta. Puudusteks on piiratud skaleeritavus ja kõrged organisatsioonilised nõudmised.
Teise põlvkonna sekveneerimine (NGS) NGS kasutab DNA ja/või RNA taseme variatsioonide tuvastamiseks suure läbilaskevõimega paralleelse sekveneerimise tehnikaid. Seda tehnikat saab kasutada nii kogu genoomi (WGS) kui ka huvipakkuvate geenipiirkondade sekveneerimiseks. WGS annab kõige põhjalikumat teavet genoomsete mutatsioonide kohta, kuid selle kliinilisel rakendamisel on palju takistusi, sealhulgas vajadus värskete kasvajakoe proovide järele (WGS ei sobi veel formaliiniga immobiliseeritud proovide analüüsimiseks) ja kõrge hind.
Sihitud NGS-sekveneerimine hõlmab kogu eksoni sekveneerimist ja sihtgeenide paneeli. Need testid rikastavad huvipakkuvaid piirkondi DNA-sondide või PCR-amplifikatsiooni abil, piirates seeläbi vajaliku sekveneerimise hulka (kogu eksoom moodustab 1–2 protsenti genoomist ja isegi suured paneelid, mis sisaldavad 500 geeni, moodustavad genoomist vaid 0,1 protsenti). Kuigi kogu eksoni sekveneerimine toimib formaliiniga fikseeritud kudedes hästi, on selle maksumus endiselt kõrge. Sihtgeenide kombinatsioonid on suhteliselt ökonoomsed ja võimaldavad testitavate geenide valimisel paindlikkust. Lisaks on vähihaigete genoomse analüüsi uue võimalusena esile kerkimas ringlev vaba DNA (cfDNA), mida tuntakse vedelbiopsiatena. Nii vähirakud kui ka normaalsed rakud võivad DNA-d vereringesse vabastada ja vähirakkudest eraldunud DNA-d nimetatakse ringlevaks kasvaja DNA-ks (ctDNA), mida saab analüüsida kasvajarakkudes võimalike mutatsioonide tuvastamiseks.
Testi valik sõltub konkreetsest kliinilisest probleemist, millega tegeletakse. Enamikku heakskiidetud ravimeetoditega seotud biomarkereid saab tuvastada FISH-, IHC- ja PCR-meetodite abil. Need meetodid on mõistlikud väikeste biomarkerite koguste tuvastamiseks, kuid need ei paranda tuvastamise efektiivsust läbilaskevõime suurenemisega ja kui tuvastatakse liiga palju biomarkereid, ei pruugi tuvastamiseks olla piisavalt kude. Mõnede spetsiifiliste vähivormide, näiteks kopsuvähi korral, kus koeproove on keeruline saada ja testida on mitu biomarkerit, on NGS-i kasutamine parem valik. Kokkuvõtteks võib öelda, et testi valik sõltub iga patsiendi puhul testitavate biomarkerite arvust ja biomarkeri suhtes testitavate patsientide arvust. Mõnel juhul piisab IHC/FISH-i kasutamisest, eriti kui sihtmärk on kindlaks tehtud, näiteks östrogeeniretseptorite, progesterooniretseptorite ja ERBB2 tuvastamine rinnavähihaigetel. Kui on vaja genoomsete mutatsioonide põhjalikumat uurimist ja potentsiaalsete terapeutiliste sihtmärkide otsimist, on NGS organiseeritum ja kulutõhusam. Lisaks võib NGS-i kaaluda juhtudel, kus IHC/FISH-i tulemused on ebamäärased või mittemääravad.

Erinevad juhised annavad juhiseid selle kohta, millised patsiendid peaksid olema geneetiliseks testimiseks sobivad. 2020. aastal avaldas ESMO täppismeditsiini töörühm esimesed NGS-testimise soovitused kaugelearenenud vähiga patsientidele, soovitades rutiinset NGS-testimist kaugelearenenud mittelamerakulise mitteväikerakulise kopsuvähi, eesnäärmevähi, kolorektaalvähi, sapijuhavähi ja munasarjavähi kasvajaproovide puhul ning 2024. aastal uuendas ESMO seda, soovitades kaasata rinnavähi ja haruldased kasvajad, näiteks seedetrakti strooma kasvajad, sarkoomid, kilpnäärmevähid ja teadmata päritoluga vähid.
2022. aastal avaldas ASCO kliinilise arvamuse somaatilise genoomi testimise kohta metastaatilise või kaugelearenenud vähiga patsientidel, et kui biomarkeriga seotud ravi on metastaatiliste või kaugelearenenud tahkete kasvajatega patsientidele heaks kiidetud, on nende patsientide puhul soovitatav geneetiline testimine. Näiteks tuleks metastaatilise melanoomiga patsientidel teha genoomne testimine BRAF V600E mutatsioonide skriinimiseks, kuna RAF ja MEK inhibiitorid on selle näidustuse jaoks heaks kiidetud. Lisaks tuleks geneetiline testimine teha ka siis, kui patsiendile manustatava ravimi suhtes on selge resistentsuse marker. Näiteks Egfrmab on KRAS-mutatsiooniga kolorektaalse vähi korral ebaefektiivne. Patsiendi sobivuse hindamisel geeni sekveneerimiseks tuleks arvestada patsiendi füüsilise seisundi, kaasuvate haiguste ja kasvaja staadiumiga, sest genoomi sekveneerimiseks vajalikud etapid, sealhulgas patsiendi nõusolek, laboratoorne töötlemine ja sekveneerimise tulemuste analüüs, nõuavad patsiendilt piisavat füüsilist võimekust ja oodatavat eluiga.
Lisaks somaatilistele mutatsioonidele tuleks mõningaid vähkkasvajaid testida ka sugurakkude geenide suhtes. Sugurakkude mutatsioonide testimine võib mõjutada raviotsuseid selliste vähivormide puhul nagu BRCA1 ja BRCA2 mutatsioonid rinna-, munasarja-, eesnäärme- ja kõhunäärmevähis. Sugurakkude mutatsioonid võivad mõjutada ka tulevasi vähi sõeluuringuid ja ennetamist patsientidel. Patsiendid, kes on potentsiaalselt sobivad sugurakkude mutatsioonide testimiseks, peavad vastama teatud tingimustele, mis hõlmavad selliseid tegureid nagu vähi esinemine perekonnas, vanus diagnoosimise ajal ja vähi tüüp. Siiski ei vasta paljud patsiendid (kuni 50%), kellel on sugurakkudes patogeensed mutatsioonid, traditsioonilistele sugurakkude mutatsioonide testimise kriteeriumidele, mis põhinevad perekonna anamneesil. Seetõttu soovitab riiklik ulatuslik vähivõrgustik (NCCN), et mutatsioonikandjate tuvastamist maksimeerida, et kõiki või enamikku rinna-, munasarja-, endomeetriumi-, kõhunäärme-, kolorektaal- või eesnäärmevähiga patsiente testitaks sugurakkude mutatsioonide suhtes.
Mis puutub geneetilise testimise ajastusse, siis kuna valdav enamus kliiniliselt olulistest juhtmutatsioonidest on klonaalsed ja vähi progresseerumise käigus suhteliselt stabiilsed, on mõistlik teha patsientidele geneetiline testimine kaugelearenenud vähi diagnoosimise ajal. Järgnevate geneetiliste testide jaoks, eriti pärast molekulaarset sihtravi, on ctDNA testimine soodsam kui kasvajakoe DNA, sest vere DNA võib sisaldada DNA-d kõigist kasvajakahjustustest, mis on soodsam teabe saamiseks kasvaja heterogeensuse kohta.
ctDNA analüüs pärast ravi võib ennustada kasvaja ravivastust ja tuvastada haiguse progresseerumist varem kui standardsed kuvamismeetodid. Siiski pole nende andmete kasutamise protokolle raviotsuste suunamiseks kehtestatud ja ctDNA analüüsi ei soovitata teha, välja arvatud kliinilistes uuringutes. ctDNA-d saab kasutada ka väikeste jääkkahjustuste hindamiseks pärast radikaalset kasvajaoperatsiooni. ctDNA testimine pärast operatsiooni on tugev haiguse progresseerumise ennustaja ja võib aidata kindlaks teha, kas patsient saab adjuvantsest keemiaravist kasu, kuid siiski ei ole soovitatav ctDNA-d kasutada väljaspool kliinilisi uuringuid adjuvantse keemiaravi otsuste suunamiseks.

Andmetöötlus Esimene samm genoomi sekveneerimisel on DNA eraldamine patsientide proovidest, teekide ettevalmistamine ja sekveneerimise algandmete genereerimine. Toorandmed vajavad edasist töötlemist, sealhulgas madala kvaliteediga andmete filtreerimist, nende võrdlemist võrdlusgenoomiga, erinevat tüüpi mutatsioonide tuvastamist erinevate analüütiliste algoritmide abil, nende mutatsioonide mõju määramist valgu translatsioonile ja iduliini mutatsioonide filtreerimist.
Juhtgeeni annotatsioon on loodud juhi- ja kaasreisijamutatsioonide eristamiseks. Juhtmutatsioonid põhjustavad kasvaja supressorgeeni aktiivsuse kadu või suurenemist. Väikesed variandid, mis viivad kasvaja supressorgeenide inaktiveerimiseni, hõlmavad nonsensmutatsioone, raaminihkemutatsioone ja võtme splaissingu saidi mutatsioone, samuti harvemaid startkoodoni deletsioone, stoppkoodoni deletsioone ja laia valikut introni insertsiooni/deletsiooni mutatsioone. Lisaks võivad missense-mutatsioonid ja väikesed introni insertsiooni/deletsiooni mutatsioonid samuti põhjustada kasvaja supressorgeeni aktiivsuse kadu, kui need mõjutavad olulisi funktsionaalseid domeene. Struktuurivariandid, mis viivad kasvaja supressorgeeni aktiivsuse kadumiseni, hõlmavad osalist või täielikku geeni deletsiooni ja muid genoomseid variante, mis viivad geeni lugemisraami hävimiseni. Väikesed variandid, mis viivad onkogeenide funktsiooni suurenemiseni, hõlmavad missense-mutatsioone ja aeg-ajalt esinevaid introni insertsioone/deletsioone, mis on suunatud olulistele valgu funktsionaalsetele domeenidele. Harvadel juhtudel võivad valgu kärpimise või splaissingu saidi mutatsioonid viia onkogeenide aktiveerimiseni. Struktuurilised variatsioonid, mis viivad onkogeeni aktiveerimiseni, hõlmavad geenide fusiooni, geenide deletsiooni ja geenide dubleerimist.
Genoomse variatsiooni kliiniline tõlgendamine hindab tuvastatud mutatsioonide kliinilist olulisust, st nende potentsiaalset diagnostilist, prognostilist või terapeutilist väärtust. Genoomse variatsiooni kliinilise tõlgendamise suunamiseks on olemas mitu tõenduspõhist hindamissüsteemi.
Memorial Sloan-Kettering Cancer Centeri täppismeditsiini onkoloogia andmebaas (OncoKB) liigitab geenivariandid neljaks tasemeks, lähtudes nende ennustusväärtusest ravimite tarvitamise seisukohast: 1./2. tase, FDA poolt heaks kiidetud ehk kliiniliselt standardsed biomarkerid, mis ennustavad konkreetse näidustuse ravivastust heakskiidetud ravimile; 3. tase, FDA poolt heaks kiidetud või heakskiitmata biomarkerid, mis ennustavad ravivastust uutele sihtravimitele, mis on kliinilistes uuringutes paljulubavaid tulemusi näidanud, ja 4. tase, FDA poolt heaks kiitmata biomarkerid, mis ennustavad ravivastust uutele sihtravimitele, mis on kliinilistes uuringutes näidanud veenvaid bioloogilisi tõendeid. Lisati viies alarühm, mis on seotud raviresistentsusega.
Ameerika Molekulaarpatoloogia Seltsi (AMP) / Ameerika Kliinilise Onkoloogia Seltsi (ASCO) / Ameerika Patoloogide Kolledži (CAP) somaatiliste variatsioonide tõlgendamise juhised jagavad somaatilised variatsioonid nelja kategooriasse: I aste, millel on tugev kliiniline tähtsus; II aste, millel on potentsiaalne kliiniline tähtsus; III aste, kliiniline tähtsus teadmata; IV aste, mille kliiniline tähtsus ei ole teada. Ainult I ja II astme variandid on raviotsuste tegemisel väärtuslikud.
ESMO molekulaarse sihtmärgi kliinilise toimivuse skaala (ESCAT) liigitab geenivariandid kuueks tasemeks: I tase – sihtmärgid, mis sobivad rutiinseks kasutamiseks; II faas – sihtmärk, mida alles uuritakse – kasutatakse tõenäoliselt patsientide populatsiooni skriinimiseks, kes võiksid sihtravimist kasu saada, kuid selle toetamiseks on vaja rohkem andmeid; III aste – sihitud geenivariandid, mis on näidanud kliinilist kasu teistes vähiliikides; IV aste – ainult sihitud geenivariandid, mida toetavad prekliinilised tõendid; V aste – on tõendeid mutatsiooni sihtimise kliinilise olulisuse kohta, kuid sihtmärgi vastane monoravim ei pikenda elulemust või saab kasutada kombineeritud ravistrateegiat; X aste – kliinilise väärtuse puudumine.